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間接競爭法ELISA操作步驟

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操作步驟


1

準備好所有需要的試劑及工作濃度的標準品。

2

分別設(shè)定標準孔、0孔和樣本孔,計算好當次試驗所需要的板條數(shù)量,將不需要的板條拆卸下來,用新的封板膜重新封好,放回裝有干燥劑的鋁箔袋

3

加標準品:標準品孔加入50 μL的2倍倍比稀釋的標準品。0孔加入50 μL標準品/樣本稀釋液。

4

加樣本:樣本孔加入50 μL的待測樣本。

5

加生物素化檢測抗體:立即每孔加入50 μL生物素化抗體工作液至反應(yīng)孔中。保證步驟3、4、5連續(xù)加樣,不要間斷。加樣過程在10 min內(nèi)完成。

6

孵育:使用新的封板膜封板。37℃靜置孵育45 min。

7

洗滌:棄掉液體,每孔加入300 μL洗液洗板,洗滌3次。每次洗板,在吸水紙上拍干。

提示:為獲得理想的實驗結(jié)果,必須移除干凈殘留液體。洗板完成之后,請立即進行下步操作,不要讓微孔板干燥。

8

加酶結(jié)合物:加入100 μL酶結(jié)合物工作液至反應(yīng)孔中。

9

孵育:使用新的封板膜封板。封板后于37℃靜置孵育30 min。

10

洗滌:棄掉液體,每孔加入300 μL洗液洗板,洗滌5次。每次洗板,在吸水紙上拍干。為獲得理想的實驗結(jié)果,必須移除干凈殘留液體。

提示:為獲得理想的實驗結(jié)果,必須移除干凈殘留液體。洗板完成之后,請立即進行下步操作,不要讓微孔板干燥。

11

加底物顯色:每孔加入90 μL顯色底物TMB,避光,37℃避光顯色15 min。

提示:可根據(jù)實際顯色情況酌情縮短或延長顯色時間,但不可超過30 min。當標準孔顏色出現(xiàn)明顯梯度時,即可終止。提前15 min打開酶標儀預(yù)熱。

12

加終止液:每孔加入50 μL終止液,終止液加入的順序應(yīng)盡量與顯色底物加入的順序相同。

提示:終止液加入后微孔板內(nèi)液體的顏色由藍色變?yōu)辄S色。如果顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色的變化明顯不均勻,請輕輕叩擊板框,水平充分混勻。

13

檢測讀數(shù):在5 min之內(nèi),使用酶標儀進行雙波長檢測,測定450 nm最大吸收波長和630 nm參考波長下的OD值。

提示:校準后的OD值為450 nm的測定值減去630 nm的測定值。(注:630 nm OD值為酶標板材質(zhì)吸收值。若不能進行雙波長檢測,可只測定450 nm波長下的OD值,但數(shù)據(jù)的準確度會降低一些)


注意事項

檢測之前請將所有的試劑、樣本平衡至室溫。

樣本復(fù)融后若有沉淀,需再次離心,取上清檢測。

試劑或樣本配制時,需充分混勻并盡量避免起泡。

標曲和樣本建議做復(fù)孔檢測。




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